NIR Fluoreszenz im FUSION-FX7 SPECTRA


In der Regel ist die Western Blot Chemilumineszenz Detektion einer Fluoreszenz-Detektion bezüglich Parametern wie Nachweisgrenze oder Signaldynamik deutlich überlegen. Dies gilt insbesondere in einem leistungsfähigen CCD Imager der FUSION Familie.

 

Dennoch hat das Interesse an Fluoreszenz-Nachweisen speziell für Westernblot-Anwendungen zugenommen. So kann es unter Umständen wünschenswert sein, ein- und dasselbe Label in verschiedenen Anwendungen einsetzen zu können (z.B. eGFP direkt in Pflanzenzellen und auch auf dem Fluoreszenz Western-Blot). Auch kann die Mehrfachmarkierung mit verschiedenen Sekundärantikörpern z.B. zur Standardisierung mit Housekeeping-Genen ohne Stripping eine interessante Option sein.

 

Bereits in der Vergangenheit konnten viele unserer FUSION-Imager mit leistungsfähigen Modulen für die UV-Fluoreszenz und für die RGB-VIS Fluoreszenz erweitert werden.

 

Im Gegensatz zur Chemilumineszenz-Detektion, bei der detektierbares Licht an einem gekoppelten Sekundärantikörper durch enzymatische Umsetzung eines Substrates entsteht, befindet sich bei einer Fluoreszenzmessung immer noch eine Lichtquelle im Messfeld (Laser, LED, UV), mit der das gekoppelte Fluorophor angeregt wird. Durch Auswahl geeigneter Emissionsfilter kann das Licht der Anregungsquelle zwar praktisch vollständig herausgefiltert werden; dennoch bleiben im Vergleich zur Chemilumineszenz noch potentielle Einflussfaktoren, die die Gesamtperformance empfindlich mindern können. Darunter ist als wichtigster Faktor insbesondere die unspezifische Autofluoreszenz anderer Substanzen in der Probe zu nennen: Proteine, Lipide, Wasser, etc..

 

Durch Auswahl geeigneter Low Fluoreszenz Membranen und Optimierung der Blotting-Parameter (Konzentration des Sekundärantikörpers, Waschlösungen, Blockierung-Agenzien) lässt sich das Auftreten von unspezifischer Autofluoreszenz deutlich verbessern. Es bleibt jedoch in der Regel ein signifikant höherer unspezifischer Hintergrund im Vergleich zur Chemilumineszenz.

 

Genau an dieser Stelle setzt die neueste Entwicklung unserer NIR-SPECTRA Technologie an. Am Ende des sichtbaren Lichtspektums (700 bis 800 nm) gehen die Extinktionskoeffizienten vieler Proteine zurück, während gleichzeitig die der Lösungsmittel (wie z.B. Wasser) erst bei höheren Wellenlängen ansteigen. Im Vergleich zu einer Anregung im UV- oder im sichtbaren RGB-Bereich kann eine Anregung im NIR-(Nahinfrarot) Bereich zu einem deutlichen Rückgang der unspezifischen Autofluoreszenz beitragen und somit das Signal-Rausch-Verhältnis und damit auch die Nachweisgrenzen deutlich verbessern.

 

 

 

Von unserer neuen NET-NIR-Technologie profitieren alle Fluoreszenz-Western Blot-Anwender, bei denen das Problem typischerweise in starker Autofluoreszenz besteht, oder bei denen eine Duplexanwendung mit möglichst niedrigem Crosstalk zwischen den beiden Kanälen zum Einsatz kommen soll. Dazu gehören insbesondere Applikationen wie:

 

·         Western Blot von kompletten Zelllysaten

 

·         Proteinbindestudien

 

·         Cell-Signalling Untersuchungen

 

·         Experimente im Bereich Protein-Protein-Interaktionen

 

·         Phosphorylierungsstudien

 

·         ... und generell alle Western-Blot-Anwendungen, bei denen zwei verschiedene Proteine auf gleicher

        Höhe laufen und daher nicht allein aufgrund Ihres Molekulargewichtes differenziert werden können.

 

 

Das FUSION NIR SPECTRA-Modul ist die jüngste Erweiterung für unsere bewährten FUSION Multi-Applikations-Imager, die damit jetzt zusätzlich zur Detektion von Chemilumineszenz, UV-Fluoreszenz und RGB (VIS)-Fluoreszenz auch NIR-IR-Fluoreszenz bieten. Das Modul als IR-Lichtquelle ist leicht nachrüstbar und wird ergänzt durch entsprechende passende Emissionsfilter.

 

Damit wird im FUSION Multi-Applikations-Imager der komplette Spektralbereich vom ultravioletten bis hin zum infraroten Wellenlängenbereich nutzbar.